16s rRNS un pilnas metagenomiskās sekvencēšanas salīdzinājums
Jau agrīni (pirmajos dzīves gados) izveidojusies zarnu trakta mikrobiota tiek arvien biežāk uzskatīta par vienu no galvenajiem cilvēka veselības stāvokļa ietekmētājiem arī turpmākās dzīves laikā. Turklāt arī dzīves laikā ir dažādi faktori, kas ietekmē mikrobiotas mainību, kā piemēram, diētas paradumi, antibakteriālās terapijas lietošana u.c. [3] .
Netieši uz zarnu trakta mikrobiotas sastāvu norāda fēču mikrobiotas analizēšana.
Ir pieejamas vairākas mūsdienīgas sekvencēšanas metodes, ar kuru palīdzību nosaka fēču mikrobiotas sastāvu: 16S rRNS un pilna metagenomiskā sekvencēšana. 16s rRNS metode tiek izmantota, lai noteiktu mikrobiotas taksonomisko sastāvu, savukārt, pilna metagenomiska sekvencēšana ļauj analizēt arī mikrobiotas funkcionalitāti un visas kopienas mijiedarbību [2; 5]. 16s rRNS sasniedz un nolasa tikai 16s rRNS gēna reģionu – šis gēns atrodams visās baktērijās un arhejā, līdz ar to paraugā ir iespējams noteikt tikai šo kopienu gēnus [4]. Metagenomiskā sekvencēšanas sniedz informāciju par kopējo genoma DNS no visiem paraugā esošajiem organismiem, līdz ar ko nav nepieciešams izolēt un kultivēt mikroorganismus, kā arī amplificēt mērķa reģionus. Tiek izmantota nākamās paaudzes sekvencēšanas tehnoloģija [5]. Ar metagenomiskās sekvencēšanas palīdzību var vienlaikus identificēt gan paraugā esošās baktērijas, gan sēnes, vīrusus, u.c. mikroorganismus, kā arī iegūt informāciju par metagenoma funkcionalitāti [4].
Pētījuma piemērs: 2021. gadā publicēts pētījums, kurā tika iekļauti jaundzimušie, 0 – 6 mēnešus veci, no dažādiem ASV štatiem (kopumā no piecām pediatru praksēm un diviem krūts barošanas atbalsta centriem) – kopumā tika savākti 229 fēču paraugi, bet analizēti tika 227 paraugi. Visiem paraugiem tika veikta metagenomiskā sekvencēšana. Tika noteikts un analizēts arī antibiotiku rezistences gēns (kas nebūtu iespējams ar 16s rRNS sekvencēšanas metodi). Visos štatos tika konstatēta augsta šī gēna sastopamība. Lielāks daudzums šī gēna tika konstatēts vecuma posmā 0 – 3 mēneši. Kā arī – vidēji 54% šo gēnu bija saistīti ar gēniem, kas nodrošina vairāku medikamentu rezistenci. Antibiotiku rezistences gēna samazināšanās tika novērota paraugos, kas tika klasificēti kā Bifidobacteriaceae enterotips, salīdzinot ar Enterobacteriaceae un Bacteroidaceae entreotipiem. Tāpat pētījumā tika konstatēts, ka Bifidobacteraceae enterotipam bija izteikti lielāka cilvēka piena oligosaharīdu utilizācijas kapacitāte [1]. Analizējot paraugus ar 16s rRNS būtu iespēja noteikt tikai baktēriju taksonomiskās vienības.
16s rRNS un metagenomiskās sekvencēšanas salīdzinājums:
| Faktors | 16s rRNS | Metagenoms |
| Izmaksas | Salīdzinoši mazākas | Salīdzinoši lielākas (2-3x) |
| Parauga sagatavošana | Līdzīga | Līdzīga |
| Taksonomiskais pārklājums | Baktērijas un Archaeae | Visas paraugā esošās taksonomiskās vienības, tajā skaitā vīrusi |
| Taksonomiskā izšķirtspēja | Baktēriju ģintis un sugas | Baktēriju sugas (arī to celmi un nukleotīdi, ja sekvencēšana ir pietiekami dziļa) |
| Funkcionalitātes noteikšana | Nē | Jā |
| Datu bāzes | Izveidotas un rūpīgi izstrādātas | Salīdzinoši jaunas, joprojām tiek uzlabotas |
| Kontaminācijas risks ar saimnieka DNS | Zems | Augsts (atšķiras no parauga veida – var mazināt, kalibrējot sekvencēšanas dziļumu) |
Vēres / Izmantotā literatūra:
- Casaburi, G., Duar, R.M., Brown, H. et al. Metagenomic insights of the infant microbiome community structure and function across multiple sites in the United States. Sci Rep 11, 1472 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-020-80583-9
- Di Segni A, Braun T, BenShoshan M, Farage Barhom S, Glick Saar E, Cesarkas K, Squires JE, Keller N, Haberman Y. Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing. J Vis Exp. 2018 Mar 19;(133):56845. doi: 10.3791/56845. PMID: 29608151; PMCID: PMC5933208.
- Sarkar A, Yoo JY, Valeria Ozorio Dutra S, Morgan KH, Groer M. The Association between Early-Life Gut Microbiota and Long-Term Health and Diseases. J Clin Med. 2021 Jan 25;10(3):459. doi: 10.3390/jcm10030459. PMID: 33504109; PMCID: PMC7865818.
- https://www.cd-genomics.com/microbioseq/resource-16s-rrna-sequencing-vs-shotgun-sequencing-for-microbial-research